Biotechnologie - Biologie - Theorie - Toelatingsexamens arts en tandarts

Biotechnologie

Biotechnologie

Voorwoord

Deze theoriehoofdstukken werden in eerste instantie samengesteld om in de theorie te voorzien die vereist is voor het afleggen van de toelatingsexamens arts en tandarts, maar heeft mettertijd een bredere bestemming gekregen, waardoor meer theorie voorzien is dan gekend moet zijn voor het toelatingsexamen. Toch is de theorie relatief beknopt gehouden: ze is vooral bedoeld voor wie het allemaal al eens gezien heeft en wil herhalen en daardoor zijn basis verstevigen. Ik denk dat ze daardoor nuttig kan zijn bij de voorbereiding van die toelatingsexamens, voor olympiades of voor een herhaling van leerstof voor het aanvangen van hogere studies. Maar als je besluit dit document te gebruiken voor welke test dan ook, check dan zelf welke leerstof gekend moet zijn op de officiële sites.
De auteur van dit document kan in geen enkel geval aansprakelijk gesteld worden voor eventuele gevolgen van of schade die kan ontstaan uit het gebruik van dit document.

Agarose-gel-elektroforese

Is een techniek om DNA met verschillende lengten te scheiden. Deze berust op het feit dat DNA negatief geladen is (want het is een zuur).
Men brengt het op een agarose-gel (agarose is een polysacharide).
Men brengt een elektrisch veld aan over de gel: + aan de tegenovergestelde kant van het DNA.
De DNA-moleculen gaan migreren naar de + kant.
De kleinste DNA moleculen migreren het snelst.
De fragmenten worden met ethidiumbromide zichtbaar gemaakt in UV-licht.

Opsporen van mutaties

Zo kan men bvb. mutaties opsporen in DNA.
Men knipt het DNA met een restrictie-enzym (zie later).
Men voert de elektroforese uit.
Men vergelijkt met het geknipte DNA van een normale persoon en het geknipte DNA van een persoon met de mutatie (de “controles”).
Opmerking: men zal meestal het DNA vermeerderen met PCR (zie verder) om voldoende DNA kopieën te hebben.

PCR (Polymerase Chain Reaction)

In 1980 door Kary Mullis ontwikkeld, hij kreeg er de Nobelprijs voor.
De techniek dient voor het maken van veel kopieën van een stukje DNA (maximaal enkele tienduizend kb (kilobasen) lang).
Dit wordt gedaan voor bijvoorbeeld het sequencen van DNA (zie verder), analyse van genen,…
Er zijn minimaal drie cyclussen nodig om één volledige kopie van het DNA te maken.
Elke cyclus bestaat uit een aantal stappen, die elk bij een welbepaalde temperatuur uitgevoerd worden, gedurende een bepaalde tijd en in een bepaalde volgorde.

PCR

Samengevat doet men in elke cyclus:
Denaturatie (openen) van de DNA keten bij 90-95 °C
Binden van primers (startstukjes) bij 50-60 °C
Ketenverlenging met Taq polymerase (DNA-polymerase) en nucleotiden bij 74 °C
Na 3 cycli heeft men een volledige kopie van het DNA-stukje gemaakt.
De cycli worden voortdurend herhaald tot er voldoende DNA-kopieën zijn.
Na 30x de 3 cycli herhalen heeft men al 1073741824 kopieën. Dit zal normaal gesproken 1 à 2 uur in beslag nemen.

PCR

1: Denaturatie bij ong. 95°C
2: Primers binden bij ong 68°C
3: Ketenverlenging bij ca. 72°C
De proportie gewenst DNA (blauw) versus ongewenst DNA (groen) neemt exponentieel toe.

DNA-sequencing

Wordt gebruikt om de basenvolgorde in een DNA-fragment te bepalen. De techniek lijkt op PCR, maar er wordt slechts één primer gebruikt en naast de normale nucleotiden voegt men ook afwijkende nucleotiden toe (ddATP, ddGTP, ddTTP, ddCTP – dd staat voor didesoxy).
Deze nucleotiden worden fluorescerend gelabeld, bvb.
ddATP: groen
ddTTP: rood
ddCTP: blauw
ddGTP: zwart
De “defecte” nucleotiden, die het ketenverlengingsproces zullen stoppen, wedijveren met de normale nucleotiden. Dus men krijgt ketens van alle lengten, op het einde waarvan er steeds een defect nucleotide zit waarvan we de kleur kunnen aflezen.

DNA-sequencing

Bijvoorbeeld: op de gel zien we voor een fragment GCGAGT het volgende (met kleurcode van hierboven):
GCGAGT
Het proces is tegenwoordig volledig geautomatiseerd: de fragmenten passeren door elektroforese op de agarosegel en passeren een laser, die de fluorescentiesignalen doorstuurt naar de computer, waar men de basensequentie gewoon kan aflezen.

Biotechnologie

Biotechnologie is het gebruiken of wijzigen van biologisch materiaal voor praktische doeleinden.
Eigenlijk wordt ze al eeuwen gebruikt: om brood te bakken, kaas te bereiden, bier te brouwen.
Ze is wel in een versnelling geraakt doordat we tegenwoordig rechtstreeks in het erfelijk materiaal van organismen kunnen ingrijpen = gentechnologie.

Restrictie-enzymen

Restrictie-enzymen maken deel uit van het natuurlijke afweersysteem van bacteriën.
Het zijn moleculaire scharen: ze knippen een specifieke basenvolgorde.
Ze worden genoemd naar het organisme waarvan ze afkomstig zijn, vb. Eco RI is afkomstig van Escherichia Coli, stam R en was het eerste restrictie-enzym dat men kon isoleren.
Eco RI knipt de volgende sequentie op de getoonde wijze:

Restrictie-enzymen

Na knippen met een restrictie-enzym krijgt men zogenaamde sticky ends, dit zijn ongepaarde basen.
De sticky ends binden gemakkelijk met andere complementaire stukjes DNA.
Als we dus twee soorten DNA (vb. van twee verschillende organismen) knippen met een bepaald restrictie-enzym, en ze daarna bij mekaar brengen, zullen ze met mekaar binden en zo hybride DNA-moleculen vormen.
Restrictie-enzymen zijn de grondslag van de ontwikkeling van gentechnologie.

Plasmiden

Bacteriën hebben één lange streng DNA als erfelijk materiaal, maar hebben daarnaast ook kleine cirkelvormige stukjes DNA met een beperkt aantal genen = de plasmiden.
Deze kunnen zichzelf kopiëren en worden gemakkelijk van de ene naar de andere bacterie doorgegeven.
Ze worden vaak in biotechnologie gebruikt om vreemde genen in andere cellen te loodsen.

Transgene organismen

Dit zijn organismen die genen van een andere soort ingebouwd kregen. De technieken om DNA een cel binnen te krijgen:
Bijvoorbeeld een transgene bacterie:
Men knipt een bepaald gen en een plasmide van de bacterie met een restrictie-enzym, brengt ze samen waardoor het gen in de plasmide ingebouwd wordt en deze recombinante plasmide wordt in de bacterie gebracht.
Het aaneenzetten van het vreemd gen en de plasmide noemt men ligeren: het wordt gedaan door DNA ligase.

Transgene organismen

Een drager waarmee men een vreemd stuk DNA inbrengt (hier een plasmide), noemt men een vector.
Het ingebrachte gen in de bacterie kan dan bijvoorbeeld het insulinegen bevatten. De bacteriën gaan zich vermenigvuldigen en insuline produceren. Ook voor de productie van groeihormoon,... werkt men op deze manier (ook gisten kunnen gebruikt worden).

Transgene organismen

Men kan ook transgene planten maken die bijvoorbeeld resistent zijn tegen bacteriën.
Ook dierlijke cellen kan men transgeen maken, bijvoorbeeld voor aanmaak van EPO,...

Virussen

Een virus is een hoeveelheid erfelijk materiaal (RNA of DNA) die omgeven is door een omhulsel van eiwitten.
Een virus wordt niet ingedeeld bij de levende organismen omdat het zich niet kan voortplanten zonder de stofwisseling en het DNA-replicatiemechanisme van een gastheercel.
Een virus injecteert haar DNA of RNA. Viraal RNA of DNA zullen gekopieerd worden door gastheerenzymen en de viruseiwitten aangemaakt.
Nieuwe virussen worden dan “geassembleerd” in de gastheercel, deze barst open (“lysis”) en nieuwe virussen komen vrij, die nieuwe cellen kunnen infecteren.

Virussen

Voorbeelden van virussen zijn: griepvirus, HIV-virus, veroorzakers van verkoudheden, hepatitis-virussen,…
Virussen kunnen in plaats van plasmiden gebruikt worden om vreemd DNA in te brengen. Met voorziet het virus van een bepaald gen, infecteert de gastheercel en het gen wordt door de gastheercel overgeschreven en eiwitten aangemaakt.

Kloneren

Dit is het creëren van een nieuw organisme uit het erfelijk materiaal van een reeds bestaand organisme.
Het wordt gedaan met behulp van kerntransplantatie: de kern van een lichaamscel van een te kloneren organisme wordt in een eicel ingebracht.
Men noemt de techniek SCNT: somatische celkerntransplantatie.
De sleutel tot het succes was het geven van een elektrische prikkel aan de eicel na de transplantatie waardoor de nieuwe celkern geherprogrammeerd bleek voor celdeling.

Dolly

Zo werd het schaap Dolly in 1996 geboren door kloneren. Dit noemt men reproductief kloneren: een volledig nieuw organisme ontstaat.
Het mitochondriaal DNA blijft wel van het ooi dat de eicel leverde.

Therapeutisch kloneren

Therapeutisch kloneren: bijvoorbeeld om nieuwe levercellen aan te maken in een patiënt.
Ook kan men hiermee medicijnen uittesten op gekloonde cellijnen van een persoon.

Kloneren van mensen

Het klonen van mensen ligt binnen handbereik, maar het onderzoek en de toepassing wordt beperkt door regelgeving, die vooral door ethische vraagstukken ingegeven wordt.
Ook moet er rekening gehouden worden met het vergrote voorkomen van afwijkingen (vooral bij gekloneerde primatencellen) en de zwakkere gezondheid zoals dit bij de reeds ontwikkelde klonen optrad.
Een reden blijkt de epigenetica (methyleringen in het kern-DNA,…) te zijn.
Ook zijn de telomeren bij klonen korter, waardoor zij vroeger sterven.

RFLP

= Restrictie Fragment Lengte Polymorfisme.
Hier gebruikt men restrictie-enzymen voor diagnostische doeleinden: men kan zien of iemand een bepaald allel heeft.
Men knipt een stuk DNA met een bepaald restrictie-enzym, een mutant zal een andere lengte hebben.

Genetische vingerafdruk

Het knippen van het DNA van iemand geeft een uniek patroon = “genetic fingerprint” (genetische vingerafdruk).
Voorbeelden van toepassingen:
daderidentificatie aan hand van DNA-stalen gevonden op plaats misdaad.
vaderschapstest: elke band op de gel moet bij vader of moeder terug te vinden zijn.
Na scheiding van de DNA-fragmenten met behulp van elektroforese worden de DNA-profielen van vader, moeder en één of meerdere kinderen vergeleken. Door het DNA-profiel van de moeder naast dat van het kind te leggen, kan nagegaan worden welk erfelijk materiaal van de moeder werd overgeërfd. Het overblijvende DNA moet dus afkomstig zijn van de biologische vader.

Genetische vingerafdruk

Komen alle noodzakelijke DNA-fragmenten in het DNA profiel van het onderzochte mannelijke individu voor, dan is hij statistisch gezien met een zeer grote waarschijnlijkheid (>99,9%) ook de echte biologische vader.
Eén fragment dat noch bij de moeder noch bij de vader wordt teruggevonden, is theoretisch voldoende om de man als biologische vader uit te sluiten.
Wie is de vader in nevenstaand gelelektroforeseresultaat? Vader A.
Moeder
Vader?

Mitochondriaal DNA

Mitochondriaal DNA (mtDNA) wordt uitsluitend door de moeder doorgegeven, het is dus identiek langs de hele lijn van de moeder.
Zo heeft men het skelet van leden van de familie van tsaar Nicholas II (familie werd bijna volledig uitgemoord) kunnen identificeren door het DNA te vergelijken met het DNA van een achterneef, de hertog van Edinburgh (wat dus identiek is).
Zo kan men door gespecialiseerde bedrijven laten bepalen of, in een bepaald stamboomonderzoek, iemand werkelijk een verwant is door naar de verschillen in het mitochondriaal DNA te kijken. Ook kan men tot ver in de tijd terug kijken hoe de voorouders in de wereld gemigreerd zijn.

Y-chromosoom

Voor de man kan dit gebeuren met het Y-chromosoom, dat niet recombineert en dus ongewijzigd van vader op zoon doorgegeven wordt.
Hiermee heeft men een zeer goed beeld gekregen van de migratie waarmee de mens zich uit Afrika naar de gehele wereld verspreid heeft.
Men heeft bijvoorbeeld kunnen afleiden dat de eerste groep die Afrika verliet ongeveer 150 mensen in aantal was.
Er zijn projecten lopende waarbij men testsetjes met 100.000 DNA varianten van heel de wereld aan particulieren te koop gaat bieden waarmee men zijn afkomst zelf kan bepalen.

Vaccins

Een vaccin is een middel om een bepaalde infectie te voorkomen.
Klassiek ging men als vaccin schadelijke virussen, vb. het griepvirus, veranderen en inbrengen. Werken met deze virussen houdt echter altijd een risico in.
Nu kan men bijvoorbeeld enkel het stukje DNA dat codeert voor het antigen van het schadelijk virus (dus dat wat de afweer zal op gang brengen) inbrengen in een ander, onschadelijk virus.
Viraal DNA
Antigen van griepvirus
Inspuiten

Gentherapie

Gentherapie is het behandelen van een ziekte door het inbrengen van een vreemd gen.
Dit zou kunnen dienen om bepaalde ziektes te genezen. Men gaat een bepaald gen in een virus inbouwen en inbrengen in een persoon (door een injectie bvb.).
Het virus infecteert bepaalde cellen, het virus bouwt het DNA in in het DNA van de gastheercel en het gen wordt overgeschreven.
Zo kan een bepaalde persoon dan bijvoorbeeld een eiwit aanmaken, dat hij oorspronkelijk niet kon aanmaken (vb. insuline bij diabetespatiënten).